PhotoShop 5+: делаем картинку с альфа-каналом и экспортируем в PNG или GIF («Save for Web...»), не забывая отметить галочку Transparency
В PhotoShop 4- «File Export/GIF89a Export», затем пипеткой выделяете тот цвет, который должен стать прозрачным.
Есть и программы типа GIF Constructor Set, которые помогают определить один из цветов палитры GIF как прозрачный.